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Dr.cell專欄 | 單細胞測序后的功能驗證實驗
發布日期:2019-08-30瀏覽:

扎實的技術基礎→合適的平臺選擇→明確的研究方向→歷經考驗的實驗技能→深入的生信挖掘→……過關斬將、步步為營,單細胞研究甚是艱辛。但這不是終點。

近期,Dr.cell發現隨著時間的推移,單細胞測序在高分文章中的成分比例有逐漸減少的趨勢,這要求科研工作者將更多的精力放在單細胞測序后功能驗證實驗上。
 
作為近幾年興起的較火的研究技術,從各領域的單細胞文獻中就能發現,研究套路基本一致。
 
研究主題主要有:
1. 尋找marker基因;
2. 新群鑒定;
3. 追蹤亞群之間的演化關系。
 
常見分析內容主要有:
1. tnse降維分析鑒定細胞群;
2. 差異基因分析鑒定marker基因;
3. 擬時軌跡分析亞群之間的演化關系;
4. marker基因的各種展示,包括熱圖、小提琴圖、散點圖等;
5. marker基因的生物學通路和功能分析。
 
 
圖1 文獻常見10X單細胞套路總結
 
 
同時,不難發現,備受CNS期刊青睞的單細胞測序文章中,前沿的研究者會不僅通過先進的單細胞平臺“尋找marker基因”或“新群鑒定”,而是將研究更進一步,通過后續功能驗證實驗,呈現出更完整的研究思路。
 
這里,通過10x單細胞相關文獻,我們整理出了單細胞測序后續功能驗證常見套路,根據難易程度進行排序我們總結如下:(仔細閱讀,不然你會遺漏關鍵點 )
 
1. RNA fish試驗
這個是文章中最常見的驗證實驗,也是推薦的最基礎最重要的實驗,適合10X單細胞測序均在RNA水平上的驗證,驗證成功率最高,也是我們推薦必須要做的保底性質的驗證實驗。Fish實驗不僅可以驗證10X的marker基因結果,同時可以觀察到marker基因對應的細胞群在組織中的空間定位。
需要注意:10X平臺測序數據一般是3端 或者5端的98bp,所以在設計fish探針的時候根據自己的數據(3端還是5端),設計探針的位置盡量和自己數據的位置接近。
 
2. 免疫熒光實驗
蛋白水平的驗證實驗,同RNA fish驗證實驗一樣可以對10X的marker基因結果驗證,也可以進行觀察marker基因對應的細胞群在組織中的空間定位,不僅如此還能觀察蛋白在細胞內的定位,根據不同的細胞器定位進行后續的功能研究提供線索。
需要注意的是免疫熒光實驗也有兩個常見的坑:
1.可能需要購買多家公司的抗體進行驗證實驗;
2.由于細胞內表達RNA和蛋白的翻譯不是絕對的線性相關,因此RNA水平和蛋白水平可能不一致,最典型的是CD34(T細胞marker),CD34在蛋白水平上是T細胞不錯的marker,但是在單細胞數據中僅僅能覆蓋大概40-60%的T細胞。
 
3. 單細胞SMART-qPCR
這個驗證實驗也是我們推薦的一個驗證實驗,同10X單細胞一樣均是RNA水平的驗證,驗證率高。
難點:
1.分離感興趣細胞群的單個細胞;
2.需要進行SMART擴增,成本上較高。
 
4. 單細胞數據的轉錄調控機制(SCENIC分析轉錄因子調控網絡)的驗證,bulk ATAC-seq
這個驗證實驗是針對做轉錄調控機制進行準備的,由于采用的是bulk ATAC-seq驗證,因此驗證的是所有群共同的調控機制。如果是想驗證某特定細胞群的調控機制,需要進行感興趣細胞群的分選,對分選后的細胞進行bulk ATAC-seq。
 
5. 特定細胞群的分選
如果能挑選出合適的膜表面marker,可以直接進行流式分選或者磁珠分選。
如果挑選的是胞內marker,需要熒光報告小鼠對marker蛋白進行熒光標記,之后才能進行后續敢興趣marker基因對應的細胞群分選。這個實驗主要是驗證新細胞群,當時也可以進行后續的SMART-qPCR和bulk ATAC-seq驗證。
 
6. 譜系示蹤技術證明群的演化關系
譜系示蹤是最近發育分化研究中比較火的技術,這個技術的關鍵是挑選合適的marker基因,而單細胞測序剛好是選擇marker基因神技術。10X單細胞測序和譜系示蹤小鼠可以進行完美搭配。
 
7. 感興趣細胞群的marker基因或者富集出的信號通路的功能驗證
難度系數最高的10X單細胞驗證實驗。根據我們的經驗10X單細胞測序平均能覆蓋的基因大概700-2000個,因此很容易漏掉生物學功能的主效基因,因此挑選marker基因進行功能實驗風險還是比較大的,但是也有高分文章進行功能實驗驗證。另外如果marker基因的功能驗證難度較大也可以放寬條件,對marker基因富集出的信號通路進行功能驗證
 
典型文獻,一一舉證,更立體的理解!
 
1. RNA FISH試驗
2018年science文章Molecular, spatial and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region利用單細胞測序找到marker基因,之后將這些marker基因設計成探針進行大腦的組織原位雜交觀察不同神經元和非神經元亞群之間的空間定位。
 
 
圖2 組織原位FISH展示神經元組織空間定位
 
2. 免疫熒光實驗
2018年cell文章“Toward Minimal Residual Disease-Directed Therapy in Melanoma”一張MITF蛋白的免疫熒光結果即是文章的證據也是整篇文章思路的源泉。作者從MITF在組織中的異質性表達整理出來了整篇單細胞文章的思路,揭示出了黑色素瘤微小殘留耐藥的重要原因。
 
 
圖3 2018年cell 黑色素瘤MITF免疫熒光結果
 
3. 單細胞SMART-qPCR
2018年cell文章“A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain”通過Gal4品系的果蠅表達GFP:R23E10-Gal4示蹤果蠅(文獻中已經報道的dFB類細胞)分選出dFB類細胞細胞通過CEL-seq(22 cells)、smart-seq2(45 cells、34 cells)進行單細胞qPCR。
 
 
圖4 2018年cell單細胞qPCR驗證
 
4. 單細胞數據的轉錄調控機制(SCENIC分析轉錄因子調控網絡)的驗證
2018年cell文章“A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain”通過SCENIC分析出了調控果蠅大腦發育的150個轉錄因子,其中onecut參與了所以細胞群的共同調控,作者用bulk ATAC-seq進行了驗證。
 
 
 
圖5 2018年cell的bulk ATAC-seq驗證
 
5. 特定細胞群的分選
2018年上Cell Reports文章“Single-Cell Transcriptional Profiling Reveals Cellular Diversity and Intercommunication in the Mouse Heart”利用單細胞測序鑒定出了心壁細胞,成纖維細胞和施旺細胞的marker基因,利用marker基因Cspg4和Pgdfrb做成熒光報告基因小鼠分選出了純度更高的心壁細胞,成纖維細胞施旺細胞。
 
 
 
圖6 2018年Cell Reports利用marker基因進行細胞群分選
 
6. 譜系示蹤技術證明群的演化關系
2014年cell文章“Identification and Specification of the Mouse Skeletal Stem Cell”利用譜系示蹤小鼠追蹤到了骨骼發育的小鼠骨骼干細胞。2018年cell文章“Identification of the Human Skeletal Stem Cell”利用單細胞測序和譜系示蹤技術配合鑒定出了人的骨骼干細胞。由于常規譜系示蹤只能同時標記一兩個marker基因,限制了多譜系分化示蹤的應用。2019年的nature文章“Molecular recording of mammalian embryogenesis”利用crispr-cas9和單細胞測序技術開發了基于條形碼的譜系示蹤技術,擴展了常規譜系示蹤技術的應用。
 
 
 
圖7 2014年cell譜系示蹤技術追蹤小鼠骨骼單細胞
 
 
圖8 2018年cell單細胞測序配合譜系示蹤追蹤人類骨骼干細胞
 
 
圖9 2019年nature條形碼譜系示蹤技術
 
7. 感興趣細胞群的marker基因或者富集出的信號通路的功能驗證
發表在2017年nature雜志上文章“Non-equivalence of Wnt and R-spondin ligands during Lgr5+ intestinal stem-cell self-renewal”對Lgr5+ ISCs不同干細胞亞群對應的兩個信號通路Wnt和RSPO信號通路進行了驗證。
 
 
 
圖10  marker基因的功能驗證實驗
 
 
總結:
 
研究人員可根據自己的單細胞數據整理出來的文章脈絡選擇性的進行驗證實驗。
•  推薦需要做的保底性質的驗證實驗兩個:RNA FISH實驗和單細胞SMART-qPCR。
•  加分性質的驗證實驗兩個:單細胞數據的轉錄調控機制(SCENIC分析轉錄因子調控網絡)的驗證和特定細胞群的分選(marker基因的熒光報告小鼠)。
•  周期較長難度較大的挑戰性質的驗證實驗兩個:marker基因或者信號通路的功能驗證實驗和譜系示蹤小鼠實驗(針對發育分化或者腫瘤克隆進化)。
各位老師可以在自己的科研需求中選擇合適自己的驗證策略。
 
福利時間:
 
 
 
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參考文獻:
 
[1] Moffitt J R , Bambah-Mukku D , Eichhorn S W , et al. Molecular, spatial and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region[J]. Science, 2018.
[2] Florian R , Aljosja R , Oskar M B , et al. Toward Minimal Residual Disease-Directed Therapy in Melanoma[J]. Cell, 2018:S0092867418307931-.
[3] Kristofer D , Jasper J , Duygu K , et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain[J]. Cell, 2018:S0092867418307207-.
[4] Skelly D A, Squiers G T, Mclellan M A, et al. Single-Cell Transcriptional Profiling Reveals Cellular Diversity and Intercommunication in the Mouse Heart[J]. Cell Reports, 2018, 22(3):600.
[5] Chan C F , Seo E , Chen J , et al. Identification and Specification of the Mouse Skeletal Stem Cell[J]. Cell, 2015, 160(1-2):285-298.
[6] Chan CKF, Gulati GS, Sinha R, et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 2018;175(1):43-56.e21
[7] Chan MM, Smith ZD, Grosswendt S, et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 2019;570(7759):77-82
[8] Yan K S , Janda C Y , Chang J , et al. Non-equivalence of Wnt and R-spondin ligands during Lgr5+ intestinal stem-cell self-renewal[J]. Nature, 2017.
 
 
 
 
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